Kỹ Thuật Phân Tích Vi Sinh Vật-Bài 2

18. Khử nhiễm và rửa:

18.1 Khử nhiễm:

       -      Dụng cụ sử dụng 1 lần khử nhiễm trước khi loại bỏ.

• Vật liệu cần khử nhiễm và loại bỏ phải được đặt trong các vật chứa.
• Hấp áp lực ở 121⁰C ít nhất 30 phút. Nới lỏng nắp trước khi hấp.

18.2 Rửa:

• Chỉ rửa dụng cụ sau khi đã khử nhiễm.
• Sau khi rửa, tráng lại bằng nước đã loại ion.

IV. Chuẩn bị và khử trùng môi trường nuôi cấy:

1. Môi trường nuôi cấy:

a/ Phân loại môi trường

 * về thành phần

 - môi trường tự nhiên

 - môi trường tổng hợp

 * về trạng thái vật lý

 - mt lỏng

 - mt đặc

 - mt xốp (mt cám, cát thạch anh thấm dung dịch dinh dưỡng…)

* Về công dụng:

 - Mt tiền tăng sinh (preenrichment)

 - Mt tăng sinh (hay tăng sinh chọn lọc)

 - Mt phân lập

 - Mt chọn lọc phân biệt

 - Mt thử phản ứng sinh hoá (còn gọi là mt chẩn đoán phân biệt hay mt chỉ thị)

 - Mt nuôi dưỡng

• Môi trường tiền tăng sinh, môi trường tăng sinh:

Là mt dạng lỏng, chứa thành phần tạo điều kiện thuận lợi cho vsv phát triển.

• Mt tăng sinh chọn lọc:

Là mt chỉ cho phép vài vsv đặc trưng phát triển, đồng thời ức chế một phần hoặc hoàn toàn sự phát triển của các vsv khác.

• Mt tăng sinh không chọn lọc:

Là mt cho phép sự phát triển của nhiều loại vsv. Vd: Nutrient broth.

• Môi trường phân lập:

Là mt rắn hoặc bán rắn cho phép vi sinh vật phát triển

Vd: Plate count agar

• Mt phân lập chọn lọc:

Là mt cho phép những vsv đích đặc trưng phát triển, đồng thời ức chế các vsv khác. Vd: XLD

• Mt phân lập không chọn lọc:

Là mt không ức chế chọn lọc các vsv. Vd PCA

• Mt phân biệt:

Là mt dùng kiểm tra một hoặc nhiều tính chất sinh lý/ sinh hóa của vsv để nhận dạng chúng. Vd: MacConkey agar, XLD agar, Lactose TTC agar.

• Mt định danh:

Là mt dùng để tạo ra một phản ứng nhận dạng đặc trưng mà không cần thêm kiểm nghiệm nhận dạng nào sau đó. Vd: Bile esculin agar, TBX agar.

b/ Pha chế mt trong PTN:

• Là một trong những bước cơ bản trong kiểm nghiệm vi sinh.
• Tuân thủ tốt các hướng dẫn thực hành trong PTN và nhà sản xuất.
• Lưu hồ sơ các dữ liệu liên quan.

b1. Nước:

• Độ dẫn điện 25µs.cm^-1ở 25⁰C.
• TPC < 10³CFU/ml.

b2. Cân mt và hòa tan vào nước.

b3. Hòa tan và phân tán.

Khuấy liên tục, đều đặn.

Mt chứa agar nên ngâm vài phút trước khi gia nhiệt.

b4.Đo và điều chỉnh pH:

Thường dùng [NaOH] = 1mol/l, [HCl] = 1mol/l

b5. Phân phối môi trường:

Bình chứa có thể tích  > 20% so thể tích mt phân phối.

b6. Tiệt trùng: Bằng hơi nước nóng hoặc bằng màng lọc

b7. Kiểm tra:

Sau khi hấp, đun sôi hay lọc, tất cả mt đều được kiểm tra: pH, màu sắc, sự vô trùng và sự ổn định lý tính.

c. Chuẩn bị môi trường để sử dụng:

c1. Làm tan môi trường agar.

Nhiệt độ mt sử dụng được khoảng 44 – 47⁰C.

c2. Đuổi không khí ra khỏi mt nc nếu cần.

c3. Thêm chất bổ sung vào mt.

c4. Chuẩn bị và bảo quản mt trong đĩa petri.

c5. Sự thải bỏ mt.

• Cách bảo quản mt sau pha chế

- Thông thường có thể bảo quản đến vài tháng ở điều kiện lạnh và tối từ 2-8⁰C.

- Một số mt (như mt có chứa mật bò) nên bảo quản ở 10-15⁰C

- Môi trường thạch không được giữ dưới 0⁰C. Mt này có thể giữ ở nhiệt phòng 1 hoặc 2 tuần nhưng phải tránh ánh sáng

-Trong trường hợp mt nc có những chất bổ sung không bền vững, tốt nhất là bảo quản mt cơ bản đã pha, sau đó trộn thêm các chất bổ sung theo đúng yêu cầu.

- Môi trường nuôi cấy nên được làm ấm đến nhiệt độ cần ủ bằng cách đưa vào tủ ấm vài giờ trước khi sử dụng.

d. Những điểm bất thường thường gặp trong pha chế mt:

d1. Mt agar không đông

d2. pH không chính xác.

d3. Màu sắc khác thường

d4. Sự xuất hiện tủa

d5. Tính chọn lọc kém

d6. Sự tạp nhiễm

d7. Chất ức chế mt/ hiệu suất pha chế thấp.

V. Mẫu phòng thử nghiệm:

1. Yêu cầu chung:

• Lấy mẫu phải tuân thủ theo đúng tiêu chuẩn cụ thể đối với từng sản phẩm.
• PTN phải nhận được đúng mẫu đại diện của sản phẩm và không bị hư hỏng hoặc bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.
• Tránh nhiễm bẩn từ bên ngoài.
• Vật chứa mẫu không được đầy quá ¾ để tránh rò rỉ và để trộn được dễ dàng trong ptn.
• Nhận dạng các mẫu rõ ràng và toàn diện, ghi lại thông tin về mẫu.
• Ghi nhiệt độ tại thời điểm thu mẫu và nhận mẫu.
• Mẫu gửi đến ptn phải còn trong vật chứa nguyên vẹn chưa mở.
• Vật chứa mẫu phải vô trùng. Nếu cần mở vật chứa mẫu thì chỉ thực hiện trong khoảng thời gian ngắn đủ để chuyển mẫu.

2. Vận chuyển:

• Vận chuyển bằng pp nhanh nhất tới ptn.
• Mẫu được bao gói sao cho tránh bị rò rỉ hoặc vỡ.
• Trên nhãn sản phẩm phải ghi rõ có cần bảo quản lạnh hay không.
• Không sử dụng đá vụn để bảo quản mẫu.

Nhiệt độ trong quá trình vận chuyển:

- Sản phẩm không dễ phân hủy: nhiệt độ phòng (<40⁰C)

- Sản phẩm đông lạnh và đông lạnh sâu: < -15⁰C, tốt nhất là < -18⁰C)

- Sản phẩm dễ phân hủy ở nhiệt độ môi trường: 1 ⁰C – 8 ⁰C.

3. Nhận mẫu:

• Kiểm tra trạng thái của mẫu khi tiếp nhận.
• Nếu trạng thái không đảm bảo hoặc nếu mẫu không đủ, thông thường ptn không được nhận.
• Mẫu nhận vào ptn phải ghi chép đầy đủ: ngày nhận, chi tiết việc lấy mẫu, tên và địa chỉ của bên yêu cầu.
• Kiểm tra càng sớm càng tốt hoặc theo sự thỏa thuận.
• Đối với sản phẩm dể bị hỏng như nhuyễn thể thì kiểm tra trong vòng 24h sau khi lấy mẫu. Cá, sữa nguyên liệu trong vòng 36h.

4. Bảo quản:

Nhiệt độ bảo quản:

- Sản phẩm không dễ phân hủy: nhiệt độ mt từ 18⁰C đến 27⁰C.

• Sản phẩm đông lạnh và đông lạnh sâu:                    < -15⁰C, tốt nhất < - 18⁰C
• Các sản phẩm khác dễ phân hủy ở nhiệt độ mt, kể cả thực phẩm bị hư hỏng: từ 3⁰C ± 2⁰C

5. Chuẩn bị huyền phù ban đầu:

• a/ Nguyên tắc: chuẩn bị huyền phù sao cho thu được sự phân bố vi sinh vật trong phần mẫu thử càng đồng đều càng tốt.
• b/ Dịch pha loãng thường dùng:
• b1/ Dd muối pepton:
• Thành phần:
• Pepton từ casein         1g
• Natri clorua               8,5g
• Nước                      1000ml
• Chuẩn bị:  Hòa tan các thành phần trong nước. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH = 7,0 ± 0,2 ở 25 ⁰C.

b2/ Dung dịch đệm pepton:

• Thành phần:
• Pepton từ các mô động vật                  10,0g
• Natri clorua                                            5,0g
• Na₂HPO₄.12 H₂O                                   9,0g
• Kali dihydro phosphat                            1,5g
• Nước                                                    1000ml
• Chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trong nước, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25⁰C
• b3/ Dịch pha loãng dùng cho các mục đích đặc biệt:
• Dd muối pepton với Bromocresol tía:
• Thành phần:
• Dd muối pepton                                 1000ml
• Bromocresol tía(dd cồn 0,04%)          0,1ml
• Chuẩn bị: Cho 0,1ml Bromocresol tía vào 1000ml dd muối pepton
• Khử trùng 121⁰C, 1atm, 15 phút. pH sau khử trùng 7,0 ± 0,2

c/ Phân phối và khử trùng:

• Phân phối với lượng cần thiết để chuẩn bị huyền phù ban đầu vào các bình, ống nghiệm có dung tích thích hợp. Sai số cho phép sau khi khử trùng không vượt quá: ±2%
• Đậy nắp các ống nghiệm hoặc các bình không quá chặt.
• Khử trùng 15 phút, 121⁰C, 1atm.

d/ Cách tiến hành:

d1/ Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu (dd pha loãng ban đầu)

• Cân một lượng m (g) với sai số cho phép ±5% hoặc đong một thể tích V(ml) với sai số cho phép ±5% (tối thiểu là 10g hoặc 10ml), của phần mẫu thử đại diện cho vào một chén đựng vô trùng hoặc túi bằng chất dẻo vô trùng.
• Cho một lượng dịch pha loãng 9 × m(g) hoặc 9 × V(ml). Lượng thêm này có thể cân hoặc đong với sai số cho phép là ±5%.
• Dịch pha loãng luôn bằng nhiệt độ phòng trong suốt quá trình thao tác, trừ trường hợp có tiêu chuẩn quy định.
• Trường hợp định lượng các bào tử, việc xử lý nhiệt huyền phù ban đầu cần thực hiện ngay sau khi chuẩn bị và làm nguội nhanh.

d2/ Các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo:

• Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.
• Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn 1cm
• Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng.
• Trộn kỹ.
• Tương tự với các độ pha loãng tiếp theo, mỗi độ pha loãng chỉ sử dụng một pipet vô trùng.

d3/ Thời gian tiến hành:

Thời gian tính từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu cho đến khi chất cấy tiếp xúc với môi trường không được vượt quá 45 phút và thời gian kể từ khi chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi bắt đầu chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo không được vượt quá 30 phút.

* Nếu nhiệt độ phòng của phòng thử nghiệm quá cao thì hai khoảng thời gian này phải giảm đi.

6/ Chuẩn bị mẫu:

6.1/ Sản phẩm đông lạnh:

Rã đông trong điều kiện vô trùng ở 18⁰C đến 27⁰C (nhiệt độ ptn) tối đa là 3h, hoặc ở 2⁰C ±2⁰C tối đa là 24h.

Khi lấy mẫu, sản phẩm vẫn còn đông lạnh thì có thể sử dụng một ít dịch pha loãng ở nhiệt độ phòng thử nghiệm để làm tan băng.

6.2/ Sản phẩm cứng và sản phẩm khô:

• Không được dập mẫu quá 2,5p/lần.
• Nếu không dập mẫu được thì phải xay hoặc nghiền nhưng không được quá 1 phút.

6.3/ Sản phẩm lỏng và không sánh đặc:

Mẫu thử trước khi phân tích phải lắc đều.

6.4/ Sản phẩm không đồng nhất:

• Lấy mẫu bằng cách ước lượng từng phần, đại diện cho các phần trong mẫu ban đầu.
• Có thể đồng hóa toàn bộ mẫu để lấy được mẫu đồng nhất.

6.5/ Mẫu phòng thử nghiệm có khối lượng bằng hoặc nhỏ hơn 50g:

Lấy toàn bộ mẫu để chuẩn bị dịch huyền phù.

6.6/ Miếng hoặc thân thịt để thử nghiệm:

Lấy mẫu sâu bên trong và bề mặt.

6.7/ Lát hoặc mẩu thịt riêng lẻ hoặc thịt đã nấu:

Lấy một dải thịt ở ngay giữa.

6.8/ Mảnh hoặc thỏi của sản phẩm đông lạnh: đồng hóa thật kỹ.

6.9/ Sản phẩm thịt có lớp màng bọc:

Tẩy trùng lớp màng và kéo tách bỏ lớp màng bằng kẹp vô trùng (nếu lớp màng không ăn được)

Cắt thành lát. Không tháo bỏ màng của các sản phẩm ở dạng nguyên liệu

6.10/ Các món ăn sơ chế:

• Có bao gói: dùng kéo hoặc dao vô trùng để thoát bỏ đối với bào bì mềm. Đối với bao bì cứng phải khử trùng thật kỹ ở ngoài bằng cồn. Tất cả thao tác đều trong điều kiện vô trùng.

6.11/ Cá tươi nguyên con:

Lấy một miếng mẫu hình khối từ cơ lưng, cắt và nghiền nhỏ trong dịch pha loãng.

6.12/ Động vật chân đầu nguyên con và thái lát:

Dùng kẹp vô trùng và dao loại bỏ da và chân. Lấy mẫu ở cơ lưng và các đoạn xúc tu.

6.13/ Động vật giáp xác nguyên con như cua:

Dùng búa, kìm, hoặc kẹp vô trùng bẻ vỡ vỏ và càng, lấy phần thịt để phân tích.

6.14/ Động vật giáp xác như tôm nước ngọt, tôm đồng, tôm hùm…(nguyên con, hoặc bỏ đầu)

Trừ các con quá nhỏ, còn lại được bóc vỏ và thịt được cắt thành từng miếng để phân tích.

6.15/ Động vật hai mảnh vỏ:

Dùng bàn chải vô trùng rửa từng con dưới vòi nước có chất lượng nước uống, đặc biệt xung quanh khớp nối hoặc miệng.

Lấy phần thịt và phần nước bên trong cho vào vật chứa vô trùng để trộn.

6.16/ Cá khô, cá muối khô:

Dùng kéo cắt từ thân cá các miếng nhỏ kể cả da.

6.17/ Cá hun khói nguyên con:

Nếu da không ăn được thì loại bỏ da. Lấy mẫu từ vùng lưng và thịt được cắt nhỏ.

6.18/ Bột mì, hạt ngũ cốc, sản phẩm phụ từ ngũ cốc, thức ăn chăn nuôi và thức ăn chăn nuôi dạng bánh:

• Lắc kỹ bột đựng trong hộp bằng tay trước khi cân mẫu thử.
• Cho 1 phần mẫu thử vào 9 phần dd muối pepton và trộn.
• Trước khi đồng hóa, để yên từ 20 phút đến 30 phút ở 18-27⁰C.

6.19/ Sôcôla:

Làm nóng trước dịch pha loãng đến 40⁰C

Cho mẫu thử đã cân vào dịch pha loãng. Lắc bằng tay để trộn đều.

Đặt hỗn hợp ở nhiệt độ phòng 20-30 phút để hóa lỏng.

6.20/ Trứng tươi nguyên quả:

Kiểm tra vỏ trứng hoặc bên trong tùy thỏa thuận giữa các bên.

• Khử trùng vỏ:

Loại bỏ các chất bẩn bằng khăn và nước rồi thấm khô.

Ngâm trong cồn 70, sau đó lấy ra để khô hoàn toàn, tránh nhiễm bẩn

6.21/ Trường hợp chung đối với sản phẩm giàu acid:

• Phải đảm bảo pH đưa về trung tính
• Nên sử dụng dịch pha loãng có bổ sung chất chỉ thị.

6.22/ Thực phẩm có hàm lượng chất béo cao trừ bơ…

• Bổ sung Tween 80 từ 1-10g/l ước chừng theo hàm lượng chất béo (ví dụ, hàm lượng béo 40% thì bổ sung 4g/l).

7. Yêu cầu đối với mẫu nước:

• Đối với nước uống, nước suối hay nước bị ô nhiễm, nhiệt độ bảo quản là dưới 10⁰C. Thời gian bảo quản tại phòng kiểm nghiệm không được quá 2 giờ.
• Vật dụng chứa nước phải đảm bảo không có vi sinh vật mục tiêu.
• Khử trùng bên ngoài vật dụng và lắc đều trước khi cấy mẫu.

• Phương pháp màng lọc

- Thường dùng định lượng vsv chỉ thị trong mâũ nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật độ vsv tương đối thấp.

- Phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vsv trong một mẫu nước trên màng lọc và xác định số tế bào dựa vào số khlạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên đĩa thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vsv cần kiểm

• Kích thước lỗ màng lọc là 0,45 mm hoặc 0,2 mm được chế tạo từ sợi thuỷ tinh siêu mảnh, sợi polypropylene, thường được cung cấp trong trạng thái vô trùng.
• Ngoài ra còn màng lọc lưới kỵ nước trên đó có in các ô vuông bằng vật liệu kỵ nước nhằm ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạc. Công thức tính cho màng lọc này:

 MPN= Nln(N/N-x), N: tổng số các ô vuông x: số ô có khlạc mọc

• Phương pháp đếm khuẩn lạc:

Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc và không chọn lọc. Do vậy phương pháp này có tên là phương pháp đếm khuẩn lạc hay đếm đĩa.

Phương pháp này có thể được thực hiện bằng kỷ thuật hộp trải hay hộp đổ với các thiết bị hỗ trợ để đọc kết quả. Trong phương pháp này, cần