KỸ tHUẬT PHÂN TÍCH VI SINH

Phần I: Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật

I. Cơ sở thử nghiệm:

1. Yêu cầu chung:

        Việc kiểm tra các mẫu giai đoạn trong sản xuất ban đầu (tiếp nhận mẫu và chuẩn bị mẫu) phải được tách riêng khỏi khu vực kiểm tra các mẫu khác để giảm nguy cơ nhiễm bẩn chéo.

2. Các vấn đề an toàn:

        Thiết kế phòng thử nghiệm phải tuân thủ các yêu cầu về an toàn tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật.

        Gồm 4 cấp nguy cơ:

- Nguy cơ cấp 1: Vi sinh vật không gây bệnh cho người hoặc động vật

• Nguy cơ cấp 2: nguồn bệnh có thể gây bệnh cho người hoặc động vật nhưng không tạo mối nguy cho nhân viên phòng thử nghiệm, cộng đồng hoặc môi trường. Nếu phòng thử nghiệm không xử lý có thể làm lây nhiễm nghiêm trọng tới con người, nhưng nếu xử lý hiệu quả thì nguy cơ phát tán lây nhiễm là hạn chế.
• Nguy cơ cấp 3:( nguy cơ cao đối với cá thể, thấp đối với cộng đồng). Nguồn bệnh thường gây bệnh cho người hoặc động vật nhưng không phát tán từ người này sang người khác. Việc xử lý có hiệu quả và các biện pháp phòng ngừa là sẵn có.
• Nguy cơ cấp 4: (Nguy cơ cao đối với cá thể và cộng đồng)                                                                   

     Nguồn bệnh thường lây nhiễm sang người hoặc động vật và có thể  trực tiếp hoặc gián tiếp phát tán dễ dàng từ người này sang người khác. Thường không có sẵn các biện pháp xử lý có hiệu quả và các biện pháp phòng ngừa thích hợp.

3. Khu vực thử nghiệm:

3.1 Yêu cầu chung:

Phòng thử nghiệm gồm có các khu vực lấy mẫu, thử nghiệm và các khu vực chung. Các khu vực này phải tách biệt nhau.

3.2 Khu vực lấy mẫu và thử nghiệm:

Gồm các khu vực tách biệt hoặc khoanh vùng riêng sau đây:

• Nơi nhận và bảo quản mẫu;
• Nơi chuẩn bị mẫu, đặc biệt là trường hợp mẫu nguyên liệu.
• Kiểm tra mẫu, ủ vi sinh vật
• Thao tác vi sinh gây bệnh giả định
• Bảo quản chủng đối chứng và các chủng khác
• Kiểm tra độ vô trùng của thực phẩm
• Khử nhiễm;
• Làm sạch dụng cụ thủy tinh và các dụng cụ khác
• Bảo quản hóa chất độc hại, tốt nhất là giữ trong tủ, hộp, phòng hoặc kho chuyên dụng.

3.3 Khu vực chung:

• Lối vào, hành lang, cầu thang, thang máy
• Khu vực hành chính
• Phòng thay áo, nhà vệ sinh
• Phòng văn thư lưu trữ;
• Nhà kho;
• Phòng nghỉ.
• 4. Bố trí và lắp đặt:
• 4.1 Mục tiêu:
• Môi trường phân tích không ảnh hưởng đến độ tin cậy của phép phân tích.
• Tránh nhiễm chéo:
• a/ xây dựng phòng thử nghiệm theo nguyên tắc “đường một chiều”
• b/ thực hiện các quy trình theo phương thức liên tiếp với các phòng ngừa thích hợp để đảm bảo phép thử và độ nguyên vẹn của mẫu.
• c/ Tách riêng các hoạt động theo thời gian hoặc không gian;
• Tránh các điều kiện vượt quá sự cho phép như: nhiệt độ, bụi, độ ẩm, hơi nước…
• Mặt bằng phải đủ rộng để giữ được vệ sinh và ngăn nắp.

4.1 Lắp đặt:

• Tường, trần và sàn nhà phải nhẵn, dễ rửa và chịu được các chất tẩy rửa và các chất khử trùng dùng trong phòng thử nghiệm.
• Không để các đường ống dẫn chất lỏng trên mặt đất đi ngang qua cơ sở thử nghiệm trừ khi chúng được bọc kín và dễ làm vệ sinh định kỳ.
• Các cửa ra vào và cửa sổ cần được đóng kín khi đang tiến hành thử để ngăn gió lùa. Thiết kế sao cho chống bụi bám và dễ lau rửa. Nhiệt độ mt xung quanh(18-270C) chất lượng không khí phải cần tương thích với việc thực hiện các phép thử.
• Lắp hệ thống bảo vệ bụi từ khu vực xử lý mt nuôi cấy khô, mẫu dạng bụi hoặc dạng bột.
• Trang bị một tủ cấy thổi không khí sạch và hoặc một tủ an toàn.

Môi trường phòng thử nghiệm cần được bảo vệ chống bức xạ mặt trời ở phía ngoài bằng cách sử dụng các tấm thủy tinh đã xử lý thích hợp. Không nên sử dụng các rèm che phía trong vì khó làm vệ sinh và trở thành nguồn tích bụi.

4.3 Các điểm khác cần được xem xét:

• Nguồn nước, chất lượng nước thích hợp cho mục đích sử dụng.
• Nguồn điện.
• Ánh sáng đầy đủ trong mọi bộ phận của phòng thử nghiệm.
• Mặt bàn và các trang bị của phòng thử nghiệm phải được chế tạo bằng vật liệu nhẵn trơn, không thấm, dễ làm sạch và khử trùng.
• Các trang thiết bị của phòng thử nghiệm phải được thiết kế sao để thuận tiện cho việc lau rửa sàn nhà.
• Các trang thiết bị, các tài liệu không sử dụng thường xuyên không để trong khu vực thử nghiệm.
• Phải có phương tiện bảo quản tài liệu.
• Bồn rửa tay….
• Các hệ thống an toàn phòng cháy, điện, thiết bị rữa mắt.
• Trang bị nồi hấp áp lực để khử nhiễm mt nc và vật liệu thải.

4.4 Làm sạch và khử trùng:

• Mặt sàn, tường, trần, mặt bàn và trang thiết bị của phòng thử nghiệm phải được bảo dưỡng thường xuyên và sửa chữa để tránh rạng nứt dẫn đến bụi bẫn có thể tích tụ và gây ra nhiễm bẩn.
• Thường xuyên lau rửa và khử trùng để giữ cho các phòng luôn trong trạng thái thích hợp để tiến hành thử nghiệm. Các bề mặt nhiễm bẩn hoặc có khả năng nhiễm bẩn cần được khử nhiễm bằng chất tẩy rửa đã có tính diệt nấm và diệt khuẩn.
• Hệ thống thông gió và các bộ lọc của chúng cần được bảo dưỡng thường xuyên và thay các bộ lọc khi cần.
• Cần kiểm tra số lượng vsv định kỳ trên các bề mặt làm việc của phòng thử nghiệm và không khí trong khu vực thử nghiệm.

II. Nhân sự:

1. Kiểm tra năng lực thực hiện của nhân viên:

           Cần được đánh giá định kỳ theo các thông số mục tiêu. Điều này bao gồm việc tham gia vào các chương trình đảm bảo chất lượng nội bộ, các thử nghiệm thành thạo….

2.       Vệ sinh:

• Phải mặc áo choàng thử nghiệm sạch và trong trạng thái tốt. Không mặc áo choàng ra khỏi khu vực làm việc và phòng thay đồ.
• Móng tay cắt ngắn.
• Rữa sạch tay và lau khô bằng giấy hoặc bằng khăn tay sử dụng một lần.
• Khi tiếp xúc với mẫu không nói chuyện, ho…
• Người bị nhiễm trùng da hoặc đang bị ốm không nên cấy mẫu vi sinh.
• Không ăn uống trong các khu vực thử nghiệm và không để thức ăn vào các tủ đựng đồ thử nghiệm.
• Không dùng miệng để hút pipet.

III. Thiết bị và dụng cụ:

1. Yêu cầu chung:

• Tất cả các thiết bị, dụng cụ phải được giữ sạch và luôn ở trạng thái sẵn sàng, sử dụng đúng mục đích, phải kiểm tra hiệu quả sử dụng trong suốt quá trình sử dụng.
• Thiết bị và các dụng cụ kiểm tra phải được hiệu chuẩn và bảo trì định kỳ, quy trình kiểm tra và kết quả phải được lưu lại.
• Tần suất kiểm tra tùy vào loại thiết bị, mức độ hoạt động của phòng thử nghiệm, và chỉ dẫn của nhà sản xuất…
• Lắp đặt thiết bị phải thích hợp cho thao tác và bảo dưỡng.
• Thiết bị kiểm soát nhiệt độ phải kiểm tra độ ổn định và tính đồng nhất của nhiệt độ trước khi bắt đầu sử dụng.

2. Tủ cấy: (Tủ bảo vệ)

a/ Các loại tủ thường sử dụng:

• Tủ an toàn loại I: không nên dùng cho các vsv có nguy cơ gây bệnh cao vì khó duy trì và bảo vệ được người thực hiện phân tích.
• Tủ an toàn loại II: bảo vệ được sản phẩm, người thực hiện và môi trường.
• Chú ý không nên sử dụng đầu đốt bằng khí hoặc lò nung trong các tủ bảo vệ. Nếu cần phải sử dụng thì đốt với ngọn lửa nhỏ sao cho không làm nhiễu loạn dòng không khí. (nên sử dụng dụng cụ dùng 1 lần)

2. Tủ cấy: (tt)

b/ Sử dụng:

• Bố trí dụng cụ và vật liệu hợp lý
• Đặt tất cả những thứ cần thiết vào trong tủ trước khi bắt đầu làm việc.
• Không lưu giữ dụng cụ trong tủ.

c/ Làm sạch và khử trùng:

• Làm sạch và khử trùng khu vực làm việc sau khi sử dụng.
• Thường xuyên kiểm tra lưới bảo vệ của bộ lọc sơ bộ và làm sạch bằng khăn vải ngâm dung dịch tẩy rửa.
• Khử trùng bằng đèn UV sau khi làm sạch.

d/ Bảo dưỡng và kiểm tra:

• Kiểm tra thường xuyên theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
• Kiểm tra định kỳ bề mặt, thành tủ và không khí trong tủ.     

 

3. Cân:

• Dùng để xác định khối lượng mẫu thử, thành phần các mt nuôi cấy và thuốc thử. Ngoài ra, chúng cũng có thể được dùng để đo các thể tích dung dịch pha loãng theo khối lượng.
• Khi cân mẫu thử sai số tối đa cho phép phải bằng 1% hoặc tốt hơn.
• Cân được đặt lên mặt phẳng nằm ngang vững chắc, đảm bảo thăng bằng, chống rung, chống trượt.
• Làm sạch và khử trùng sau mỗi lần sử dụng.

                

4. Máy đo pH:

• Đo pH của môi trường nuôi cấy.
• Đọc giá trị pH sau khi đã ổn định, ghi lại giá trị pH đến hai chữ số thập phân. Giá trị pH ổn định khi đo trong 5s dao động không quá 0,02 đơn vị pH, và cân bằng trong khoảng 30s.
• Hàng ngày trước mỗi lần sử dụng, kiểm tra máy theo chỉ dẫn của nhà sản xuất, sử dụng ít nhất hai hoặc ba dung dịch đệm chuẩn, các dung dịch này phải bao trùm các giá trị pH cần đo.
• Sau mỗi lần sử dụng, tráng đầu đo của các điện cực trong nước cất hoặc nước đã loại ion, phải thường xuyên rửa các điện cực thật sạch và bảo quản các điện cực theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

 

5. Nồi hấp áp lực:

• Là thiết bị đạt được nhiệt độ của hơi nước bão hòa và được dùng để diệt các vsv.
• Để diệt vsv, hơi bão hòa trong buồng phải có nhiệt độ ít nhất là 1210C.
• Trong một chu kỳ khử trùng không thể khử trùng cùng một lúc dụng cụ sạch( và/ hoặc mt nuôi cấy) với các dụng cụ đã sử dụng (và/ hoặc mt đã nuôi cấy).
• Tốt nhất là sử dụng nồi hấp riêng biệt cho hai quá trình này.
• Không lấy vật liệu và dụng cụ ra khỏi nồi hấp áp lực khi nhiệt độ chưa giảm đến dưới 800C.
• Định kỳ làm sạch khoang chứa, bộ lọc xả và cửa kín.   

 

6. Tủ ấm:

*mô tả:

• Tủ ấm bao gồm một buồng giữ nhiệt có nhiệt độ ổn định và phân phối đều, với sai số nhiệt độ tối đa cho phép quy định trong tiêu chuẩn.

*những chú ý khi sử dụng:

• Nhiệt độ mt phải thấp hơn nhiệt độ bên trong tủ ấm.
• Các thành của tủ phải tránh ánh sáng mặt trời chiếu thẳng.
• Tránh mở tủ ấm nhiều lần trong thời gian dài.
• Khi xếp mẫu vào tủ ấm phải chú ý tới sự lưu thông không khí.
• Làm sạch và khử trùng thành trong và ngoài tủ ấm, nếu thích hợp, lau sạch bụi hệ thống thông gió.
• Kiểm tra sự ổn định nhiệt độ và sự phân bố nhiệt bằng nhiệt kế biết trước độ chính xác và dải nhiệt thích hợp. Nhiệt kế được dùng để kiểm tra nhiệt độ hàng ngày, được gắn ở một vị trí cố định để đạt được nhiệt độ đích, nhiệt kế này phải ngâm trong glycerol đựng trong chai gắn xi kín.

 

7. Tủ lạnh:

• Nhiệt độ bảo quản: 3±20C (sai số tối đa cho phép)
• sử dụng: để tránh nhiễm bẩn chéo phải sử dụng  các khu vực tách biệt nhau:

1) Môi trường cấy chưa cấy và thuốc thử

2) Mẫu thử.

3) Các chủng vi sinh và các môi trường đã cấy.

Các tủ lạnh, các ngăn lạnh và phòng bảo quản lạnh cần  được sắp xếp sao cho đảm bảo được sự thông khí và giảm thiểu khả năng gây nhiễm bẩn chéo.  

• kiểm tra: Mỗi ngày làm việc phải kiểm tra nhiệt độ của từng ngăn bằng một nhiệt kế hoặc bằng đầu dò được đặt cố định. Độ chính xác yêu cầu của thiết bị kiểm tra nhiệt độ phụ thuộc vào mục đích sử dụng.
• Bảo dưỡng và làm sạch:

Phải thường xuyên thực hiện các công việc sau đây:

• Lau bụi ở các cánh quạt hoặc ở các tấm trao đổi nhiệt phía ngoài.
• Làm tan băng

Làm sạch và khử trùng mặt trong của tủ.

8. Tủ đông lạnh:

• Dùng lưu mẫu thực phẩm. Nhiệt độ tốt nhất là -180C.

9. Tủ đông lạnh sâu:

   Dùng bảo quản chủng vi sinh vật.

10. Bể điều nhiệt:

• Mục đích sử dụng chính như sau:

• Ủ mt nuôi cấy ở nhiệt độ quy định
• Duy trì mt thạch tan chảy vô trùng trong khi chuẩn bị  mt.
• Xử lý nhiệt các huyền phù ban đầu ở nhiệt độ quy định.

11. Tủ sấy:

Dùng để diệt các vi sinh vật bằng nhiệt khô ở nhiệt độ 1800C trong khoảng 2h

• chỉ khử trùng dụng cụ bằng kim loại hoặc bằng thuỷ tinh. Không khử trùng dụng cụ bằng chất dẻo, cao su. Trước khi khử trùng phải làm sạch dụng cụ.
• Nếu khử trùng dụng cụ bằng thuỷ tinh thì phải kiểm tra thường xuyên độ chính xác của chúng.
• Sau khi khử trùng dụng cụ thuỷ tinh cần được để nguội trong tủ trước khi lấy ra.
• Nhiệt độ của tủ phải thường xuyên kiểm tra và ghi lại trong mỗi lần sử dụng.

 

12. Kính hiển vi quang học:

Dùng để kiểm tra hình thái, tính di động…

Hàng ngày sau khi sử dụng phải lau sạch thấu kính bằng giấy lau kính chuyên dụng. Thường dùng Xylen để loại bỏ hết dầu còn dính.

 

13. Lò vi sóng:

• Dùng sóng cực ngắn để làm nóng môi trường nuôi cấy ở áp suất khí quyển.
• Nên sử dụng lò có gắn hệ xoay.
• Nới lỏng nút trước khi làm nóng. Không sử dụng dụng cụ bằng kim loại, kể cả nắp đậy bằng kim loại.
• Khi làm tan mt thạch nên đặt ở mức năng lượng thấp và cốc nước để kiểm soát nhiệt độ.
• Thời gian sau khi gia nhiệt và trước khi lấy sản phẩm ra khỏi lò nên kéo dài 5 phút.

• Chú ý:
• Không làm nóng mt có chứa các thành phần dễ bị hỏng do nhiệt
• Kiểm tra và cài đặt mức năng lượng thích hợp trước khi đưa vào sử dụng.

 

14. Thiết bị đếm khuẩn lạc:

- Các thiết bị đếm khuẩn lạc thủ công sử dụng dụng cụ đếm sử dụng áp lực và số hiển thị là tổng số đếm các khuẩn lạc.

- Giữ thiết bị sạch và không bụi; tránh vạch lên các bề mặt đếm.

 

15. Bếp điện và lò nung:

• Là các thiết bị đốt nóng khống chế nhiệt độ ổn định.
• Không sử dụng bếp điện và lò nung không có hệ thống khuấy từ để chuẩn bị môi trường.
• Làm sạch ngay sau khi thiết bị nguội.

 

16. Pipet và pipet tự động:

• Pipet Pasteur hoặc pipet chia độ và đầu tip của pipet cần được đậy bằng bông không hấp thụ.
• Không hút bằng miệng.
• Nếu các ống hoặc pittông của pipet tự động bị nhiễm bẩn thì tháo rời chúng để khử nhiễm và làm sạch. Sau khi lắp ráp lại cần thực hiện hiệu chuẩn.

 

17. Chuẩn bị dụng cụ thủy tinh và các vật liệu của phòng thử nghiệm:

• Yêu cầu đảm bảo độ sạch và vô trùng cho đến khi sử dụng.
• Các ống nghiệm và chai lọ phải đậy kín bằng cách thích hợp.
• Dụng cụ khử trùng cần được đặt trong các hộp chuyên dụng hoặc được gói trong chất liệu thích hợp (giấy chuyên dụng, giấy nhôm…)

  17.1 Khử trùng bằng nhiệt khô:

Đặt các dụng cụ thủy tinh… trong tủ khử trùng ít nhất 1h ở 1700C hoặc tương đương.

  17.2 Khử trùng bằng nhiệt ẩm:

Là pp hiệu quả nhất. Nhiệt độ khử trùng 1210C ít nhất 15 phút.

18. Khử nhiễm và rửa:

18.1 Khử nhiễm:

       -      Dụng cụ sử dụng 1 lần khử nhiễm trước khi loại bỏ.

• Vật liệu cần khử nhiễm và loại bỏ phải được đặt trong các vật chứa.
• Hấp áp lực ở 1210C ít nhất 30 phút. Nới lỏng nắp trước khi hấp.

18.2 Rửa:

• Chỉ rửa dụng cụ sau khi đã khử nhiễm.
• Sau khi rửa, tráng lại bằng nước đã loại ion.

IV. Chuẩn bị và khử trùng môi trường nuôi cấy:

1. Môi trường nuôi cấy:

a/ Phân loại môi trường

 +Về thành phần

 - môi trường tự nhiên

 - môi trường tổng hợp

 +Về trạng thái vật lý

 - mt lỏng

 - mt đặc

 - mt xốp (mt cám, cát thạch anh thấm dung dịch dinh dưỡng…)

 +Về công dụng:

 - Mt tiền tăng sinh (preenrichment)

 - Mt tăng sinh (hay tăng sinh chọn lọc)

 - Mt phân lập

 - Mt chọn lọc phân biệt

 - Mt thử phản ứng sinh hoá (còn gọi là mt chẩn đoán phân biệt hay mt chỉ thị)

 - Mt nuôi dưỡng

• Môi trường tiền tăng sinh, môi trường tăng sinh:

Là mt dạng lỏng, chứa thành phần tạo điều kiện thuận lợi cho vsv phát triển.

• Mt tăng sinh chọn lọc:

Là mt chỉ cho phép vài vsv đặc trưng phát triển, đồng thời ức chế một phần hoặc hoàn toàn sự phát triển của các vsv khác.

• Mt tăng sinh không chọn lọc:

Là mt cho phép sự phát triển của nhiều loại vsv. Vd: Nutrient broth.

• Môi trường phân lập:

Là mt rắn hoặc bán rắn cho phép vi sinh vật phát triển

Vd: Plate count agar

• Mt phân lập chọn lọc:

Là mt cho phép những vsv đích đặc trưng phát triển, đồng thời ức chế các vsv khác. Vd: XLD

• Mt phân lập không chọn lọc:

Là mt không ức chế chọn lọc các vsv. Vd PCA

• Mt phân biệt:

Là mt dùng kiểm tra một hoặc nhiều tính chất sinh lý/ sinh hóa của vsv để nhận dạng chúng. Vd: MacConkey agar, XLD agar, Lactose TTC agar.

• Mt định danh:

Là mt dùng để tạo ra một phản ứng nhận dạng đặc trưng mà không cần thêm kiểm nghiệm nhận dạng nào sau đó. Vd: Bile esculin agar, TBX agar.

b/ Pha chế mt trong PTN:

• Là một trong những bước cơ bản trong kiểm nghiệm vi sinh.
• Tuân thủ tốt các hướng dẫn thực hành trong PTN và nhà sản xuất.
• Lưu hồ sơ các dữ liệu liên quan.

b1. Nước:

• Độ dẫn điện 25µs.cm-1ở 250C.
• TPC < 103CFU/ml.

b2. Cân mt và hòa tan vào nước.

b3. Hòa tan và phân tán.

Khuấy liên tục, đều đặn.

Mt chứa agar nên ngâm vài phút trước khi gia nhiệt.

b4. Đo và điều chỉnh pH:

Thường dùng [NaOH] = 1mol/l, [HCl] = 1mol/l

b5. Phân phối môi trường:

Bình chứa có thể tích > 20% so thể tích mt phân phối.

b6. Tiệt trùng: Bằng hơi nước nóng hoặc bằng màng lọc

b7. Kiểm tra:

Sau khi hấp, đun sôi hay lọc, tất cả mt đều được kiểm tra: pH, màu sắc, sự vô trùng và sự ổn định lý tính.

c. Chuẩn bị môi trường để sử dụng:

c1. Làm tan môi trường agar.

Nhiệt độ mt sử dụng được khoảng 44 – 470C.

c2. Đuổi không khí ra khỏi mt nc nếu cần.

c3. Thêm chất bổ sung vào mt.

c4. Chuẩn bị và bảo quản mt trong đĩa petri.

c5. Sự thải bỏ mt.

• Cách bảo quản mt sau pha chế

- Thông thường có thể bảo quản đến vài tháng ở điều kiện lạnh và tối từ 2-80C.

- Một số mt (như mt có chứa mật bò) nên bảo quản ở 10-150C

- Môi trường thạch không được giữ dưới 00C. Mt này có thể giữ ở nhiệt phòng 1 hoặc 2 tuần nhưng phải tránh ánh sáng

-Trong trường hợp mt nc có những chất bổ sung không bền vững, tốt nhất là bảo quản mt cơ bản đã pha, sau đó trộn thêm các chất bổ sung theo đúng yêu cầu.

- Môi trường nuôi cấy nên được làm ấm đến nhiệt độ cần ủ bằng cách đưa vào tủ ấm vài giờ trước khi sử dụng.

d. Những điểm bất thường thường gặp trong pha chế mt:

d1. Mt agar không đông

d2. pH không chính xác.

d3. Màu sắc khác thường

d4. Sự xuất hiện tủa

d5. Tính chọn lọc kém

d6. Sự tạp nhiễm

d7. Chất ức chế mt/ hiệu suất pha chế thấp.

V. Mẫu phòng thử nghiệm:

1. Yêu cầu chung:

• Lấy mẫu phải tuân thủ theo đúng tiêu chuẩn cụ thể đối với từng sản phẩm.
• PTN phải nhận được đúng mẫu đại diện của sản phẩm và không bị hư hỏng hoặc bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.
• Tránh nhiễm bẩn từ bên ngoài.
• Vật chứa mẫu không được đầy quá ¾ để tránh rò rỉ và để trộn được dễ dàng trong ptn.
• Nhận dạng các mẫu rõ ràng và toàn diện, ghi lại thông tin về mẫu.
• Ghi nhiệt độ tại thời điểm thu mẫu và nhận mẫu.
• Mẫu gửi đến ptn phải còn trong vật chứa nguyên vẹn chưa mở.
• Vật chứa mẫu phải vô trùng. Nếu cần mở vật chứa mẫu thì chỉ thực hiện trong khoảng thời gian ngắn đủ để chuyển mẫu.

2. Vận chuyển:

• Vận chuyển bằng pp nhanh nhất tới ptn.
• Mẫu được bao gói sao cho tránh bị rò rỉ hoặc vỡ.
• Trên nhãn sản phẩm phải ghi rõ có cần bảo quản lạnh hay không.
• Không sử dụng đá vụn để bảo quản mẫu.

Nhiệt độ trong quá trình vận chuyển:

- Sản phẩm không dễ phân hủy: nhiệt độ phòng (<400C)

- Sản phẩm đông lạnh và đông lạnh sâu: < -150C, tốt nhất là < -180C)

- Sản phẩm dễ phân hủy ở nhiệt độ môi trường: 1 0C – 8 0C.

3. Nhận mẫu:

• Kiểm tra trạng thái của mẫu khi tiếp nhận.
• Nếu trạng thái không đảm bảo hoặc nếu mẫu không đủ, thông thường ptn không được nhận.
• Mẫu nhận vào ptn phải ghi chép đầy đủ: ngày nhận, chi tiết việc lấy mẫu, tên và địa chỉ của bên yêu cầu.
• Kiểm tra càng sớm càng tốt hoặc theo sự thỏa thuận.
• Đối với sản phẩm dể bị hỏng như nhuyễn thể thì kiểm tra trong vòng 24h sau khi lấy mẫu. Cá, sữa nguyên liệu trong vòng 36h.

4. Bảo quản:

Nhiệt độ bảo quản:

- Sản phẩm không dễ phân hủy: nhiệt độ mt từ 180C đến 270C.

• Sản phẩm đông lạnh và đông lạnh sâu:                    < -150C, tốt nhất < - 180C
• Các sản phẩm khác dễ phân hủy ở nhiệt độ mt, kể cả thực phẩm bị hư hỏng: từ 30C ± 20C

5. Chuẩn bị huyền phù ban đầu:

• a/ Nguyên tắc: chuẩn bị huyền phù sao cho thu được sự phân bố vi sinh vật trong phần mẫu thử càng đồng đều càng tốt.
• b/ Dịch pha loãng thường dùng:
• b1/ Dd muối pepton:
• Thành phần:
• Pepton từ casein         1g
• Natri clorua               8,5g
• Nước                      1000ml
• Chuẩn bị:  Hòa tan các thành phần trong nước. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH = 7,0 ± 0,2 ở 25 0C.

b2/ Dung dịch đệm pepton:

• Thành phần:
• Pepton từ các mô động vật                  10,0g
• Natri clorua                                            5,0g
• Na2HPO4.12 H2O                                   9,0g
• Kali dihydro phosphat                            1,5g
• Nước                                                    1000ml
• Chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trong nước, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 250C
• b3/ Dịch pha loãng dùng cho các mục đích đặc biệt:
• Dd muối pepton với Bromocresol tía:
• Thành phần:
• Dd muối pepton                                 1000ml
• Bromocresol tía(dd cồn 0,04%)          0,1ml
• Chuẩn bị: Cho 0,1ml Bromocresol tía vào 1000ml dd muối pepton
• Khử trùng 1210C, 1atm, 15 phút. pH sau khử trùng 7,0 ± 0,2

c/ Phân phối và khử trùng:

• Phân phối với lượng cần thiết để chuẩn bị huyền phù ban đầu vào các bình, ống nghiệm có dung tích thích hợp. Sai số cho phép sau khi khử trùng không vượt quá: ±2%
• Đậy nắp các ống nghiệm hoặc các bình không quá chặt.
• Khử trùng 15 phút, 1210C, 1atm.

d/ Cách tiến hành:

d1/ Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu (dd pha loãng ban đầu)

• Cân một lượng m (g) với sai số cho phép ±5% hoặc đong một thể tích V(ml) với sai số cho phép ±5% (tối thiểu là 10g hoặc 10ml), của phần mẫu thử đại diện cho vào một chén đựng vô trùng hoặc túi bằng chất dẻo vô trùng.
• Cho một lượng dịch pha loãng 9 × m(g) hoặc 9 × V(ml). Lượng thêm này có thể cân hoặc đong với sai số cho phép là ±5%.
• Dịch pha loãng luôn bằng nhiệt độ phòng trong suốt quá trình thao tác, trừ trường hợp có tiêu chuẩn quy định.
• Trường hợp định lượng các bào tử, việc xử lý nhiệt huyền phù ban đầu cần thực hiện ngay sau khi chuẩn bị và làm nguội nhanh.

d2/ Các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo:

• Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.
• Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn 1cm
• Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng.
• Trộn kỹ.
• Tương tự với các độ pha loãng tiếp theo, mỗi độ pha loãng chỉ sử dụng một pipet vô trùng.

d3/ Thời gian tiến hành:

Thời gian tính từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu cho đến khi chất cấy tiếp xúc với môi trường không được vượt quá 45 phút và thời gian kể từ khi chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi bắt đầu chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo không được vượt quá 30 phút.

* Nếu nhiệt độ phòng của phòng thử nghiệm quá cao thì hai khoảng thời gian này phải giảm đi.

6/ Chuẩn bị mẫu:

6.1/ Sản phẩm đông lạnh:

Rã đông trong điều kiện vô trùng ở 180C đến 270C (nhiệt độ ptn) tối đa là 3h, hoặc ở 20C ±20C tối đa là 24h.

Khi lấy mẫu, sản phẩm vẫn còn đông lạnh thì có thể sử dụng một ít dịch pha loãng ở nhiệt độ phòng thử nghiệm để làm tan băng.

6.2/ Sản phẩm cứng và sản phẩm khô:

• Không được dập mẫu quá 2,5p/lần.
• Nếu không dập mẫu được thì phải xay hoặc nghiền nhưng không được quá 1 phút.

6.3/ Sản phẩm lỏng và không sánh đặc:

Mẫu thử trước khi phân tích phải lắc đều.

6.4/ Sản phẩm không đồng nhất:

• Lấy mẫu bằng cách ước lượng từng phần, đại diện cho các phần trong mẫu ban đầu.
• Có thể đồng hóa toàn bộ mẫu để lấy được mẫu đồng nhất.

6.5/ Mẫu phòng thử nghiệm có khối lượng bằng hoặc nhỏ hơn 50g:

Lấy toàn bộ mẫu để chuẩn bị dịch huyền phù.

6.6/ Miếng hoặc thân thịt để thử nghiệm:

Lấy mẫu sâu bên trong và bề mặt.

6.7/ Lát hoặc mẩu thịt riêng lẻ hoặc thịt đã nấu:

Lấy một dải thịt ở ngay giữa.

6.8/ Mảnh hoặc thỏi của sản phẩm đông lạnh: đồng hóa thật kỹ.

6.9/ Sản phẩm thịt có lớp màng bọc:

Tẩy trùng lớp màng và kéo tách bỏ lớp màng bằng kẹp vô trùng (nếu lớp màng không ăn được)

Cắt thành lát. Không tháo bỏ màng của các sản phẩm ở dạng nguyên liệu

6.10/ Các món ăn sơ chế:

• Có bao gói: dùng kéo hoặc dao vô trùng để thoát bỏ đối với bào bì mềm. Đối với bao bì cứng phải khử trùng thật kỹ ở ngoài bằng cồn. Tất cả thao tác đều trong điều kiện vô trùng.

6.11/ Cá tươi nguyên con:

Lấy một miếng mẫu hình khối từ cơ lưng, cắt và nghiền nhỏ trong dịch pha loãng.

6.12/ Động vật chân đầu nguyên con và thái lát:

Dùng kẹp vô trùng và dao loại bỏ da và chân. Lấy mẫu ở cơ lưng và các đoạn xúc tu.

6.13/ Động vật giáp xác nguyên con như cua:

Dùng búa, kìm, hoặc kẹp vô trùng bẻ vỡ vỏ và càng, lấy phần thịt để phân tích.

6.14/ Động vật giáp xác như tôm nước ngọt, tôm đồng, tôm hùm…(nguyên con, hoặc bỏ đầu)

Trừ các con quá nhỏ, còn lại được bóc vỏ và thịt được cắt thành từng miếng để phân tích.

6.15/ Động vật hai mảnh vỏ:

Dùng bàn chải vô trùng rửa từng con dưới vòi nước có chất lượng nước uống, đặc biệt xung quanh khớp nối hoặc miệng.

Lấy phần thịt và phần nước bên trong cho vào vật chứa vô trùng để trộn.

6.16/ Cá khô, cá muối khô:

Dùng kéo cắt từ thân cá các miếng nhỏ kể cả da.

6.17/ Cá hun khói nguyên con:

Nếu da không ăn được thì loại bỏ da. Lấy mẫu từ vùng lưng và thịt được cắt nhỏ.

6.18/ Bột mì, hạt ngũ cốc, sản phẩm phụ từ ngũ cốc, thức ăn chăn nuôi và thức ăn chăn nuôi dạng bánh:

• Lắc kỹ bột đựng trong hộp bằng tay trước khi cân mẫu thử.
• Cho 1 phần mẫu thử vào 9 phần dd muối pepton và trộn.
• Trước khi đồng hóa, để yên từ 20 phút đến 30 phút ở 18-270C.

6.19/ Sôcôla:

Làm nóng trước dịch pha loãng đến 400C

Cho mẫu thử đã cân vào dịch pha loãng. Lắc bằng tay để trộn đều.

Đặt hỗn hợp ở nhiệt độ phòng 20-30 phút để hóa lỏng.

6.20/ Trứng tươi nguyên quả:

Kiểm tra vỏ trứng hoặc bên trong tùy thỏa thuận giữa các bên.

• Khử trùng vỏ:

Loại bỏ các chất bẩn bằng khăn và nước rồi thấm khô.

Ngâm trong cồn 70, sau đó lấy ra để khô hoàn toàn, tránh nhiễm bẩn

6.21/ Trường hợp chung đối với sản phẩm giàu acid:

• Phải đảm bảo pH đưa về trung tính
• Nên sử dụng dịch pha loãng có bổ sung chất chỉ thị.

6.22/ Thực phẩm có hàm lượng chất béo cao trừ bơ…

• Bổ sung Tween 80 từ 1-10g/l ước chừng theo hàm lượng chất béo (ví dụ, hàm lượng béo 40% thì bổ sung 4g/l).

7. Yêu cầu đối với mẫu nước:

• Đối với nước uống, nước suối hay nước bị ô nhiễm, nhiệt độ bảo quản là dưới 100C. Thời gian bảo quản tại phòng kiểm nghiệm không được quá 2 giờ.
• Vật dụng chứa nước phải đảm bảo không có vi sinh vật mục tiêu.
• Khử trùng bên ngoài vật dụng và lắc đều trước khi cấy mẫu.

• Phương pháp màng lọc

- Thường dùng định lượng vsv chỉ thị trong mâũ nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật độ vsv tương đối thấp.

- Phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vsv trong một mẫu nước trên màng lọc và xác định số tế bào dựa vào số khlạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên đĩa thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vsv cần kiểm

• Kích thước lỗ màng lọc là 0,45 mm hoặc 0,2 mm được chế tạo từ sợi thuỷ tinh siêu mảnh, sợi polypropylene, thường được cung cấp trong trạng thái vô trùng.
• Ngoài ra còn màng lọc lưới kỵ nước trên đó có in các ô vuông bằng vật liệu kỵ nước nhằm ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạc. Công thức tính cho màng lọc này:

 MPN= Nln(N/N-x), N: tổng số các ô vuông x: số ô có khlạc mọc

• Phương pháp đếm khuẩn lạc:

Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc và không chọn lọc. Do vậy phương pháp này có tên là phương pháp đếm khuẩn lạc hay đếm đĩa.

Phương pháp này có thể được thực hiện bằng kỷ thuật hộp trải hay hộp đổ với các thiết bị hỗ trợ để đọc kết quả. Trong phương pháp này, cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho xuất hiện khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán.

• Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa.
• Phương pháp này thường cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất 2 đĩa ở mỗi nồng độ.
• Kết quả đếm và mật độ tế bào thường được trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml (colony forming unit)
• Phương pháp MPN

 (phương pháp có số xác suất cao nhất)

 Là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vsv có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau

• Thường thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng liên tiếp (gồm 9 ống)
• Ghi lại hiện tượng các ống nghiệm dương tính ở từng nồng độ. Dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vsv theo đơn vị MPN/100ml hay MPN/g mẫu.

• Phương pháp màng lọc

- Thường dùng định lượng vsv chỉ thị trong mâũ nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật độ vsv tương đối thấp.

- Phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vsv trong một mẫu nước trên màng lọc và xác định số tế bào dựa vào số khlạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên đĩa thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vsv cần kiểm.

• Kích thước lỗ màng lọc là 0,45 mm hoặc 0,2 mm được chế tạo từ sợi thuỷ tinh siêu mảnh, sợi polypropylene, thường được cung cấp trong trạng thái vô trùng.
• Ngoài ra còn màng lọc lưới kỵ nước trên đó có in các ô vuông bằng vật liệu kỵ nước nhằm ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạc. Công thức tính cho màng lọc này:

 MPN= Nln(N/N-x), N: tổng số các ô vuông; x: số ô có khuẩn lạc mọc

• Phương pháp đếm khuẩn lạc:

Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc và không chọn lọc. Do vậy phương pháp này có tên là phương pháp đếm khuẩn lạc hay đếm đĩa.

Phương pháp này có thể được thực hiện bằng kỷ thuật hộp trải hay hộp đổ với các thiết bị hỗ trợ để đọc kết quả. Trong phương pháp này, cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho xuất hiện khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán.

• Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa.
• Phương pháp này thường cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất 2 đĩa ở mỗi nồng độ.
• Kết quả đếm và mật độ tế bào thường được trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml (colony forming unit)
• Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất)

 Là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vsv có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau.

• Thường thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng liên tiếp (gồm 9 ống)

Ghi lại hiện tượng các ống nghiệm dương tính ở từng nồng độ. Dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vsv theo đơn vị MPN/100ml hay MPN/g mẫu.