Kỹ Thuật Phân Tích Vi Sinh Vật-Bài 1

Phần I: Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật

I. Cơ sở thử nghiệm:

1. Yêu cầu chung:

        Việc kiểm tra các mẫu giai đoạn trong sản xuất ban đầu (tiếp nhận mẫu và chuẩn bị mẫu) phải được tách riêng khỏi khu vực kiểm tra các mẫu khác để giảm nguy cơ nhiễm bẩn chéo.

2. Các vấn đề an toàn:

        Thiết kế phòng thử nghiệm phải tuân thủ các yêu cầu về an toàn tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật.

        Gồm 4 cấp nguy cơ:

- Nguy cơ cấp 1: Vi sinh vật không gây bệnh cho người hoặc động vật

• Nguy cơ cấp 2: nguồn bệnh có thể gây bệnh cho người hoặc động vật nhưng không tạo mối nguy cho nhân viên phòng thử nghiệm, cộng đồng hoặc môi trường. Nếu phòng thử nghiệm không xử lý có thể làm lây nhiễm nghiêm trọng tới con người, nhưng nếu xử lý hiệu quả thì nguy cơ phát tán lây nhiễm là hạn chế.
• Nguy cơ cấp 3:( nguy cơ cao đối với cá thể, thấp đối với cộng đồng). Nguồn bệnh thường gây bệnh cho người hoặc động vật nhưng không phát tán từ người này sang người khác. Việc xử lý có hiệu quả và các biện pháp phòng ngừa là sẵn có.
• Nguy cơ cấp 4: (Nguy cơ cao đối với cá thể và cộng đồng)                                                                   

     Nguồn bệnh thường lây nhiễm sang người hoặc động vật và có thể  trực tiếp hoặc gián tiếp phát tán dễ dàng từ người này sang người khác. Thường không có sẵn các biện pháp xử lý có hiệu quả và các biện pháp phòng ngừa thích hợp.

3. Khu vực thử nghiệm:

3.1 Yêu cầu chung:

Phòng thử nghiệm gồm có các khu vực lấy mẫu, thử nghiệm và các khu vực chung. Các khu vực này phải tách biệt nhau.

3.2 Khu vực lấy mẫu và thử nghiệm:

Gồm các khu vực tách biệt hoặc khoanh vùng riêng sau đây:

• Nơi nhận và bảo quản mẫu;
• Nơi chuẩn bị mẫu, đặc biệt là trường hợp mẫu nguyên liệu.
• Kiểm tra mẫu, ủ vi sinh vật
• Thao tác vi sinh gây bệnh giả định
• Bảo quản chủng đối chứng và các chủng khác
• Kiểm tra độ vô trùng của thực phẩm
• Khử nhiễm;
• Làm sạch dụng cụ thủy tinh và các dụng cụ khác
• Bảo quản hóa chất độc hại, tốt nhất là giữ trong tủ, hộp, phòng hoặc kho chuyên dụng.

3.3 Khu vực chung:

• Lối vào, hành lang, cầu thang, thang máy
• Khu vực hành chính
• Phòng thay áo, nhà vệ sinh
• Phòng văn thư lưu trữ;
• Nhà kho;
• Phòng nghỉ.
• 4. Bố trí và lắp đặt:
• 4.1 Mục tiêu:
• Môi trường phân tích không ảnh hưởng đến độ tin cậy của phép phân tích.
• Tránh nhiễm chéo:
• a/ xây dựng phòng thử nghiệm theo nguyên tắc “đường một chiều”
• b/ thực hiện các quy trình theo phương thức liên tiếp với các phòng ngừa thích hợp để đảm bảo phép thử và độ nguyên vẹn của mẫu.
• c/ Tách riêng các hoạt động theo thời gian hoặc không gian;
• Tránh các điều kiện vượt quá sự cho phép như: nhiệt độ, bụi, độ ẩm, hơi nước…
• Mặt bằng phải đủ rộng để giữ được vệ sinh và ngăn nắp.

4.1 Lắp đặt:

• Tường, trần và sàn nhà phải nhẵn, dễ rửa và chịu được các chất tẩy rửa và các chất khử trùng dùng trong phòng thử nghiệm.
• Không để các đường ống dẫn chất lỏng trên mặt đất đi ngang qua cơ sở thử nghiệm trừ khi chúng được bọc kín và dễ làm vệ sinh định kỳ.
• Các cửa ra vào và cửa sổ cần được đóng kín khi đang tiến hành thử để ngăn gió lùa. Thiết kế sao cho chống bụi bám và dễ lau rửa. Nhiệt độ mt xung quanh(18-27⁰C) chất lượng không khí phải cần tương thích với việc thực hiện các phép thử.
• Lắp hệ thống bảo vệ bụi từ khu vực xử lý mt nuôi cấy khô, mẫu dạng bụi hoặc dạng bột.
• Trang bị một tủ cấy thổi không khí sạch và hoặc một tủ an toàn.

Môi trường phòng thử nghiệm cần được bảo vệ chống bức xạ mặt trời ở phía ngoài bằng cách sử dụng các tấm thủy tinh đã xử lý thích hợp. Không nên sử dụng các rèm che phía trong vì khó làm vệ sinh và trở thành nguồn tích bụi.

4.3 Các điểm khác cần được xem xét:

• Nguồn nước, chất lượng nước thích hợp cho mục đích sử dụng.
• Nguồn điện.
• Ánh sáng đầy đủ trong mọi bộ phận của phòng thử nghiệm.
• Mặt bàn và các trang bị của phòng thử nghiệm phải được chế tạo bằng vật liệu nhẵn trơn, không thấm, dễ làm sạch và khử trùng.
• Các trang thiết bị của phòng thử nghiệm phải được thiết kế sao để thuận tiện cho việc lau rửa sàn nhà.
• Các trang thiết bị, các tài liệu không sử dụng thường xuyên không để trong khu vực thử nghiệm.
• Phải có phương tiện bảo quản tài liệu.
• Bồn rửa tay….
• Các hệ thống an toàn phòng cháy, điện, thiết bị rữa mắt.
• Trang bị nồi hấp áp lực để khử nhiễm mt nc và vật liệu thải.

4.4 Làm sạch và khử trùng:

• Mặt sàn, tường, trần, mặt bàn và trang thiết bị của phòng thử nghiệm phải được bảo dưỡng thường xuyên và sửa chữa để tránh rạng nứt dẫn đến bụi bẫn có thể tích tụ và gây ra nhiễm bẩn.
• Thường xuyên lau rửa và khử trùng để giữ cho các phòng luôn trong trạng thái thích hợp để tiến hành thử nghiệm. Các bề mặt nhiễm bẩn hoặc có khả năng nhiễm bẩn cần được khử nhiễm bằng chất tẩy rửa đã có tính diệt nấm và diệt khuẩn.
• Hệ thống thông gió và các bộ lọc của chúng cần được bảo dưỡng thường xuyên và thay các bộ lọc khi cần.
• Cần kiểm tra số lượng vsv định kỳ trên các bề mặt làm việc của phòng thử nghiệm và không khí trong khu vực thử nghiệm.

II. Nhân sự:

1. Kiểm tra năng lực thực hiện của nhân viên:

           Cần được đánh giá định kỳ theo các thông số mục tiêu. Điều này bao gồm việc tham gia vào các chương trình đảm bảo chất lượng nội bộ, các thử nghiệm thành thạo….

2.       Vệ sinh:

• Phải mặc áo choàng thử nghiệm sạch và trong trạng thái tốt. Không mặc áo choàng ra khỏi khu vực làm việc và phòng thay đồ.
• Móng tay cắt ngắn.
• Rữa sạch tay và lau khô bằng giấy hoặc bằng khăn tay sử dụng một lần.
• Khi tiếp xúc với mẫu không nói chuyện, ho…
• Người bị nhiễm trùng da hoặc đang bị ốm không nên cấy mẫu vi sinh.
• Không ăn uống trong các khu vực thử nghiệm và không để thức ăn vào các tủ đựng đồ thử nghiệm.
• Không dùng miệng để hút pipet.

III. Thiết bị và dụng cụ:

1. Yêu cầu chung:

• Tất cả các thiết bị, dụng cụ phải được giữ sạch và luôn ở trạng thái sẵn sàng, sử dụng đúng mục đích, phải kiểm tra hiệu quả sử dụng trong suốt quá trình sử dụng.
• Thiết bị và các dụng cụ kiểm tra phải được hiệu chuẩn và bảo trì định kỳ, quy trình kiểm tra và kết quả phải được lưu lại.
• Tần suất kiểm tra tùy vào loại thiết bị, mức độ hoạt động của phòng thử nghiệm, và chỉ dẫn của nhà sản xuất…
• Lắp đặt thiết bị phải thích hợp cho thao tác và bảo dưỡng.
• Thiết bị kiểm soát nhiệt độ phải kiểm tra độ ổn định và tính đồng nhất của nhiệt độ trước khi bắt đầu sử dụng.

2. Tủ cấy: (Tủ bảo vệ)

a/ Các loại tủ thường sử dụng:

• Tủ an toàn loại I: không nên dùng cho các vsv có nguy cơ gây bệnh cao vì khó duy trì và bảo vệ được người thực hiện phân tích.
• Tủ an toàn loại II: bảo vệ được sản phẩm, người thực hiện và môi trường.
• Chú ý không nên sử dụng đầu đốt bằng khí hoặc lò nung trong các tủ bảo vệ. Nếu cần phải sử dụng thì đốt với ngọn lửa nhỏ sao cho không làm nhiễu loạn dòng không khí. (nên sử dụng dụng cụ dùng 1 lần)

2. Tủ cấy: (tt)

b/ Sử dụng:

• Bố trí dụng cụ và vật liệu hợp lý
• Đặt tất cả những thứ cần thiết vào trong tủ trước khi bắt đầu làm việc.
• Không lưu giữ dụng cụ trong tủ.

c/ Làm sạch và khử trùng:

• Làm sạch và khử trùng khu vực làm việc sau khi sử dụng.
• Thường xuyên kiểm tra lưới bảo vệ của bộ lọc sơ bộ và làm sạch bằng khăn vải ngâm dung dịch tẩy rửa.
• Khử trùng bằng đèn UV sau khi làm sạch.

d/ Bảo dưỡng và kiểm tra:

• Kiểm tra thường xuyên theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
• Kiểm tra định kỳ bề mặt, thành tủ và không khí trong tủ.     

3. Cân:

• Dùng để xác định khối lượng mẫu thử, thành phần các mt nuôi cấy và thuốc thử. Ngoài ra, chúng cũng có thể được dùng để đo các thể tích dung dịch pha loãng theo khối lượng.
• Khi cân mẫu thử sai số tối đa cho phép phải bằng 1% hoặc tốt hơn.
• Cân được đặt lên mặt phẳng nằm ngang vững chắc, đảm bảo thăng bằng, chống rung, chống trượt.
• Làm sạch và khử trùng sau mỗi lần sử dụng.

                

4. Máy đo pH:

• Đo pH của môi trường nuôi cấy.
• Đọc giá trị pH sau khi đã ổn định, ghi lại giá trị pH đến hai chữ số thập phân. Giá trị pH ổn định khi đo trong 5s dao động không quá 0,02 đơn vị pH, và cân bằng trong khoảng 30s.
• Hàng ngày trước mỗi lần sử dụng, kiểm tra máy theo chỉ dẫn của nhà sản xuất, sử dụng ít nhất hai hoặc ba dung dịch đệm chuẩn, các dung dịch này phải bao trùm các giá trị pH cần đo.
• Sau mỗi lần sử dụng, tráng đầu đo của các điện cực trong nước cất hoặc nước đã loại ion, phải thường xuyên rửa các điện cực thật sạch và bảo quản các điện cực theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

5. Nồi hấp áp lực:

• Là thiết bị đạt được nhiệt độ của hơi nước bão hòa và được dùng để diệt các vsv.
• Để diệt vsv, hơi bão hòa trong buồng phải có nhiệt độ ít nhất là 121⁰C.
• Trong một chu kỳ khử trùng không thể khử trùng cùng một lúc dụng cụ sạch( và/ hoặc mt nuôi cấy) với các dụng cụ đã sử dụng (và/ hoặc mt đã nuôi cấy).
• Tốt nhất là sử dụng nồi hấp riêng biệt cho hai quá trình này.
• Không lấy vật liệu và dụng cụ ra khỏi nồi hấp áp lực khi nhiệt độ chưa giảm đến dưới 80⁰C.
• Định kỳ làm sạch khoang chứa, bộ lọc xả và cửa kín.   

​​​​​​​

6. Tủ ấm:

*mô tả:

• Tủ ấm bao gồm một buồng giữ nhiệt có nhiệt độ ổn định và phân phối đều, với sai số nhiệt độ tối đa cho phép quy định trong tiêu chuẩn.

*những chú ý khi sử dụng:

• Nhiệt độ mt phải thấp hơn nhiệt độ bên trong tủ ấm.
• Các thành của tủ phải tránh ánh sáng mặt trời chiếu thẳng.
• Tránh mở tủ ấm nhiều lần trong thời gian dài.
• Khi xếp mẫu vào tủ ấm phải chú ý tới sự lưu thông không khí.
• Làm sạch và khử trùng thành trong và ngoài tủ ấm, nếu thích hợp, lau sạch bụi hệ thống thông gió.
• Kiểm tra sự ổn định nhiệt độ và sự phân bố nhiệt bằng nhiệt kế biết trước độ chính xác và dải nhiệt thích hợp. Nhiệt kế được dùng để kiểm tra nhiệt độ hàng ngày, được gắn ở một vị trí cố định để đạt được nhiệt độ đích, nhiệt kế này phải ngâm trong glycerol đựng trong chai gắn xi kín.

7. Tủ lạnh:

• Nhiệt độ bảo quản: 3±2⁰C (sai số tối đa cho phép)
• sử dụng: để tránh nhiễm bẩn chéo phải sử dụng  các khu vực tách biệt nhau:

1) Môi trường cấy chưa cấy và thuốc thử

2) Mẫu thử.

3) Các chủng vi sinh và các môi trường đã cấy.

Các tủ lạnh, các ngăn lạnh và phòng bảo quản lạnh cần  được sắp xếp sao cho đảm bảo được sự thông khí và giảm thiểu khả năng gây nhiễm bẩn chéo.  

• kiểm tra: Mỗi ngày làm việc phải kiểm tra nhiệt độ của từng ngăn bằng một nhiệt kế hoặc bằng đầu dò được đặt cố định. Độ chính xác yêu cầu của thiết bị kiểm tra nhiệt độ phụ thuộc vào mục đích sử dụng.
• Bảo dưỡng và làm sạch:

Phải thường xuyên thực hiện các công việc sau đây:

• Lau bụi ở các cánh quạt hoặc ở các tấm trao đổi nhiệt phía ngoài.
• Làm tan băng

Làm sạch và khử trùng mặt trong của tủ.

8. Tủ đông lạnh:

• Dùng lưu mẫu thực phẩm. Nhiệt độ tốt nhất là -18⁰C.

9. Tủ đông lạnh sâu:

   Dùng bảo quản chủng vi sinh vật.

10. Bể điều nhiệt:

• Mục đích sử dụng chính như sau:

• Ủ mt nuôi cấy ở nhiệt độ quy định
• Duy trì mt thạch tan chảy vô trùng trong khi chuẩn bị  mt.
• Xử lý nhiệt các huyền phù ban đầu ở nhiệt độ quy định.

11. Tủ sấy:

Dùng để diệt các vi sinh vật bằng nhiệt khô ở nhiệt độ 180⁰C trong khoảng 2h

• chỉ khử trùng dụng cụ bằng kim loại hoặc bằng thuỷ tinh. Không khử trùng dụng cụ bằng chất dẻo, cao su. Trước khi khử trùng phải làm sạch dụng cụ.
• Nếu khử trùng dụng cụ bằng thuỷ tinh thì phải kiểm tra thường xuyên độ chính xác của chúng.
• Sau khi khử trùng dụng cụ thuỷ tinh cần được để nguội trong tủ trước khi lấy ra.
• Nhiệt độ của tủ phải thường xuyên kiểm tra và ghi lại trong mỗi lần sử dụng.

12. Kính hiển vi quang học:

Dùng để kiểm tra hình thái, tính di động…

Hàng ngày sau khi sử dụng phải lau sạch thấu kính bằng giấy lau kính chuyên dụng. Thường dùng Xylen để loại bỏ hết dầu còn dính.

13. Lò vi sóng:

• Dùng sóng cực ngắn để làm nóng môi trường nuôi cấy ở áp suất khí quyển.
• Nên sử dụng lò có gắn hệ xoay.
• Nới lỏng nút trước khi làm nóng. Không sử dụng dụng cụ bằng kim loại, kể cả nắp đậy bằng kim loại.
• Khi làm tan mt thạch nên đặt ở mức năng lượng thấp và cốc nước để kiểm soát nhiệt độ.
• Thời gian sau khi gia nhiệt và trước khi lấy sản phẩm ra khỏi lò nên kéo dài 5 phút.

​​​​​​​

• Chú ý:
• Không làm nóng mt có chứa các thành phần dễ bị hỏng do nhiệt
• Kiểm tra và cài đặt mức năng lượng thích hợp trước khi đưa vào sử dụng.

14. Thiết bị đếm khuẩn lạc:

- Các thiết bị đếm khuẩn lạc thủ công sử dụng dụng cụ đếm sử dụng áp lực và số hiển thị là tổng số đếm các khuẩn lạc.

- Giữ thiết bị sạch và không bụi; tránh vạch lên các bề mặt đếm.

15. Bếp điện và lò nung:

• Là các thiết bị đốt nóng khống chế nhiệt độ ổn định.
• Không sử dụng bếp điện và lò nung không có hệ thống khuấy từ để chuẩn bị môi trường.
• Làm sạch ngay sau khi thiết bị nguội.

16. Pipet và pipet tự động:

• Pipet Pasteur hoặc pipet chia độ và đầu tip của pipet cần được đậy bằng bông không hấp thụ.
• Không hút bằng miệng.
• Nếu các ống hoặc pittông của pipet tự động bị nhiễm bẩn thì tháo rời chúng để khử nhiễm và làm sạch. Sau khi lắp ráp lại cần thực hiện hiệu chuẩn.

17. Chuẩn bị dụng cụ thủy tinh và các vật liệu của phòng thử nghiệm:

• Yêu cầu đảm bảo độ sạch và vô trùng cho đến khi sử dụng.
• Các ống nghiệm và chai lọ phải đậy kín bằng cách thích hợp.
• Dụng cụ khử trùng cần được đặt trong các hộp chuyên dụng hoặc được gói trong chất liệu thích hợp (giấy chuyên dụng, giấy nhôm…)

  17.1 Khử trùng bằng nhiệt khô:

Đặt các dụng cụ thủy tinh… trong tủ khử trùng ít nhất 1h ở 170⁰C hoặc tương đương.

  17.2 Khử trùng bằng nhiệt ẩm:

Là pp hiệu quả nhất. Nhiệt độ khử trùng 121⁰C ít nhất 15 phút.

18. Khử nhiễm và rửa:

Chia sẻ:

• 
• 
• 
•